nervo4ka | Занимательная микроскопия: зубной налет

*
В нашем университете существует специальная летняя программа для "студентов из глубинки", которые только что поступили в университет и с осени начнут полноценно учиться. Для того, чтобы они не впали в шок от количества научной информации и исследовательских возможностей, которых во многих школах США просто нет (как сравнение: школа в деревне Гадюкино с населением 20 тыс человек и гимназия в Москве. Выпускники из этих школ в универе окажутся на разных стартовых позициях), для них проводят вводный трехнедельный курс, читают лекции и показывают лаборатории. Центр микроскопии тоже в списке, поэтому нам нужно показать что-то интересное, но при этом не запредельное для понимания.

Обычно в качестве эксперимента делают простенький соскоб слизистой рта и смотрят на получившиеся эпителиальные клетки разными методами. Я об этом рассказывала в прошлый раз. А я решила немного разнообразить этот метод и заодно показать, что во рту обитает миллионы бактерий разных форм и видов. Микробиолог я или где? 8)) Так что сегодня буду рассказывать о зубном налете и показывать тусовку бактерий из своего рта. Надо сказать, что в процессе сбора информации узнала много нового при том, что мой диссер был немного созвучен с этой темой.

Типы бактерий
Прежде, чем я начну рассказывать о зубном налете, который на 70% состоит из бактерий, хочется немного напомнить школьный учебник по биологии за 5 класс и рассказать, что бактерии можно разделить на группы.

Во-первых, по форме:
- круглые (кокки). Если они образуют цепочку из двух клеток - диплококки. Если цепочка длинная - стрептококки. Если клетки в виде кластера - стафилококки. И тд.
- палочки (бациллы). Сюда можно отнести и возбудителя сибирской язвы и дружелюбные полезные лактобактерии.
- прочие формы (спиральные, завитые). Сюда относится мой любимый холерный вибрион (V. cholerae), который я изучала на PhD, и прочие болезнетворные (и безобидные тоже) бактерии типа трепонемы (вызывает сифилис) или H. pylori (провоцирует гастрит).

Во-вторых, по строению и биохимическим свойствам клеточной стенки:
Клеточная стенка - оболочка клетки, расположенная снаружи от цитоплазматической мембраны и выполняющая структурные, защитные и транспортные функции. В 19 веке был разработан Метод Грама (фамилия такая, никакого отношения к измерению массы 8)), который позволяет окрашивать клеточную стенку бактерий в разные цвета.

- Грам-положительные бактерии (большинство кокков) приобретают темно-синий цвет.
- Грам-отрицательные (например, всем известная палочка E. coli) окрашиваются в красный или розовый цвет.

На картинке показано строение клеточной стенки у Грам (+) и Грам (-) бактерий. В случае первых слой пептидогликанов толстый и образует плотную оболочку, которая и окрашивается в синий цвет. У Грам (-) бактерий слой пептидогликанов тонкий.

Зубной налет и этапы его формирования
Зубной налет - это биофильм (по-русски "биопленка"), в состав которого входит более 1000 видов бактерий, а так же вырабатываемые ими продукты жизнедеятельности. Устойчивая структура зубного налёта обеспечивается липким матриксом, который защищает входящие в его состав бактерии от действия неблагоприятных факторов окружающей среды. То есть это особая форма сосуществования бактерий разных видов на поверхности зуба (и не только, но мы сегодня говорим о зубах), которая приносит его обитателям ощутимую выгоду для выживания и добывания питательных веществ.

Схематическое формирование биофильма выглядит так. Отдельные клетки бактерий прикрепляются к поверхности и начинают вырабатывать липкую "слизь" - экзополисахариды (ЭПС) и гликопротеины, которые помогают бактериям хорошо закрепиться и привлечь других бактерий, которые не могут сами инициировать приклепление. Дружной кучей они начинают быстро размножаться и увеличиваться в размерах образуя структуру, которая по форме напоминает гриб на ножке. В какой-то момент наступает стабилизация, и отдельные бактерии покидают построенный "домик", чтобы найти себе другую поверхность для жизни. Как правило, это происходит в случае, когда не хватает питательных веществ. **На самом деле все гораздо сложнее, и я бью себя по рукам, чтобы не углубиться в молекулярные механизмы, quorum sensing, борьбу за ресурсы, комменсализм и прочие детали, для понимания которых придется написать целый трактат**.

А это налет на зубах (биофильм) в схематичном изображении. Выглядит как поляна с грибами, состоящая из огромного разнообразия бактерий.

Формирование зубного налета происходит в определенной последовательности и включает в себя несколько стадий.

1) После чистки зубов уже через 2-4 часа поверхность зуба заселяют "ранние колонизаторы". Это непатогенные Грам (+) кокки. Затем к ним присоединятся разные палочки, и все вместе они образут первичную пленку на зубах, которую еще не видно. Бактерии получаются нутриенты из слюны и еды, которая попадает в рот.
2) Следом за ними появляются бактерии-мостики - длинные палочки и филаменты, которые помогают менее "липким" бактериям зацепиться за строящийся биофильм.
3) Если плохо следить за гигиеной рта и зубов, то уже через 4-7 дней биофильм разрастается, утолщается и становится привлекательным местом для жизни патогенных бактерий, что влечет за собой воспаление тканей десен.

А что сахар, чем он вреден? Сахар используется бактериями как источник еды и энергии, а в процессе метаболизма выделяется кислота. Она и становится причиной разрушений эмали и деминерализации зубов. Ткань зуба под эмалью - это тоже отличный источник еды для бактерий, поэтому они начинают разрастаться и продолжать свое пакостливое дело. Чем больше на зубах налета, тем бОльший процент патогенных бактерий способных разрушать зубы, там находится. Так что гигиена полости рта (чистка, флосс, регулярный осмотр у дантиста) и твердая пища, которая естественным образом очищает зубы, наше все!

КАРТИНКИ
- К сожалению, у меня не было реагентов для окраски бактерий по Граму, поэтому я использовала другой универсальный краситель. Он окрашивает полисахариды в фиолетовый цвет, а их достаточно в любой бактерии или клетке. Без красителя бактерии под микроскопом увидеть практически невозможно, поэтому пришлось красить.
- Использовала 3 метода микроскопирования: Bright Field, Phase-contrast, DIC.
- Объектив 100х, увеличение в 1000 раз.

****
Bright Field: хорошо различимы круглые бактерии кокки и палочки разной длины, в том числе огромные филаменты.

Видно, что палочки образуют цепочки из нескольких клеток.

Phase-contrast: для бактерий это не самый информативный метод.

DIC: А тут уже интересно, потому что бактерии приобрели 3D объем.

А тут мне за одно попалась та самая эпителиальная клетка полости рта, про которую я рассказывала в прошлый раз. Краситель отлично выделил ее ядро.

Bright Field